时间：2021.10.29

　　博奥麦斯一直秉承紧跟前沿技术的准则，现重磅推出新技术—— DIA 磷酸化定量修饰组技术，为您的科研助力！

　　蛋白质磷酸化修饰是生物体内存在最为广泛的一种翻译后修饰类型，调节了包括细胞增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动等过程在内的所有活动。分析研究蛋白质的磷酸化修饰状态，有助于进一步挖掘与疾病发生发展相关的重要生物标志物。但是DDA技术的半随机性使得磷酸化蛋白质组学的重复性在大量样本的检测中具有一定挑战性。随着快速扫描高分辨率串联质谱仪的出现，DIA技术已成为蛋白质组学的新宠。DIA可以无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值更少。于是，DIA磷酸化蛋白质组走上舞台。

　　那DIA磷酸化蛋白质组有什么突出的优势呢？让我们从文献中一探究竟。

　　案例一、DIA磷酸化技术开发研究

　　2020年哥本哈根大学健康与医学科学院蛋白研究中心Jesper V. Olsen团队在《Nature Communications》发表了题为“Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need forspectral libraries”的研究论文。首次应用了DIA磷酸化蛋白质组分析方法，将DIA从蛋白质分析延伸至磷酸化蛋白质组分析。其可以分为建库法和非建库法（又称“dDIA”）。此研究通过优化单次分析工作流程鉴定了高于DDA三倍的母离子（28765 : 9048）和两倍的磷酸肽（13220 : 7285），重现性也高于DDA方法（R2=0.93 : R2=0.89）。为了证明此处开发的基于DIA的快速位点特异性磷酸蛋白质组学工作流程的强大功能和可扩展性，使用30种激酶抑制剂将其应用于表皮生长因子信号通路中的十种主要蛋白激酶的磷酸化位点。用两种不同浓度（0.1和1μM）的抑制剂预处理表皮生长因子刺激的RPE1细胞，并用LC-MS/MS对每个样品进行DIA分析。结果表明有化合物的表皮生长因子受体抑制（EGFRi）效果良好。为了进一步验证激酶抑制剂的特异性，分析了单个激酶的已知底物，结果表明了良好的重复性。证明DIA磷酸化可以真实的反应生物学调控过程。

　　案例二、通路机制相关研究

　　2020年，浙江省重症肝胰腺疾病诊治重点实验室，应用DDA和DIA对对照组和重症急性胰腺炎（SAP）组之间差异表达的磷酸化蛋白进行了定量分析。结果表明DIA优于DDA，鉴定出的磷酸化多肽数量增加了近1.76倍。DDA鉴定的98.48%的磷酸化肽段和98.77%磷酸化蛋白同时也被DIA发现。DIA鉴定出的99.25%磷酸化肽和86.17%的磷酸化蛋白与DDA鉴定相同，仅75个磷酸化肽被DDA唯一鉴定。对于磷酸化位点鉴定，DDA数据包含5491个磷酸化丝氨酸（PS）、669个磷酸化苏氨酸（PT）和25个磷酸化酪氨酸（Py）残基，但是少于DIA数据，后者包含9603个磷酸化丝氨酸、1628个磷酸化苏氨酸和51个磷酸化酪氨酸残基。磷酸化蛋白的GO功能分析和通路分析显示内分泌系统、信号转导、细胞生长和死亡、运输和分解代谢占较大比例。随后的GSEA分析表明分别来自蛋白质组学和磷酸蛋白质组的21个和10个gene groups在SAP中显著上调。揭示SAP磷酸蛋白groups中核因子KappaB（NFkB）的激活在胰腺炎的早期发展和持续发展过程中起着至关重要的作用，调节NFKB的活性可能是一种可行的治疗方案。

　　案例三、药物耐受相关研究

　　今年5月，台湾大学Yu-Ju Chen团队同样在《Nature Communications》发表了题为“A data-independent acquisition-based global phosphoproteomics system enables deep profiling”的学术文章。研究者通过DIA磷酸化蛋白质组学技术，利用肺癌细胞系和患者来源的组织，单次DIA磷酸化实验实现了38255个亚磷酸肽（20420个一级亚磷酸肽）的深度量化。使用合成磷酸肽对DIA定量性能进行测试，高相关性和高重新性表明了DIA磷酸化技术的高准确性。使用NSCLC PC9和CL68细胞裂解产物，评估单次DIA分析在磷酸化蛋白质组覆盖率、CV%和数据完整性方面的定量性能。PC9 细胞中的单次DDA分析定量出17430个磷酸肽，对应于12959个磷酸位点（10768个1类位点），但只有53%的位点在20% CV 的三次重复中可重现。dDIA分析实现了19024个磷酸化位点（9746个1类位点），并且在20%的CV内定量了高达90%。建库法DIA鉴定出33330个磷酸位点（17810个1类位点），并且79%在20%的CV内被定量，1类磷酸位点鉴别量比分别使用DDA和dDIA高出1.9倍和1.6倍。随后，在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平建立EGFR-TKI耐药细胞模型，并区分新激酶和底物的表达和位点特异性磷酸化的变化。DIA在蛋白质组和磷酸蛋白质组水平上实现了对EGFR-TKI耐药细胞模型的高灵敏且高度可重复的分析，揭示了EGFR-TKI 耐药途径的高覆盖率，并区分了新型激酶和底物的表达和位点特异性磷酸化的改变。对患者的高度异质性肿瘤和正常组织定量分析也揭示了DIA技术在用于了解疾病机制和挖掘潜在药物靶点的能力。此方法同样可以拓展应用于其他癌症。

　　从文献数据中不难看出，DIA技术鉴别磷酸化肽段以及磷酸化位点，都远远优于传统DDA技术，从激酶研究到药物靶点研究，从动物模型组织到临床研究，DIA技术都展现了其不可或缺的优势。这得益于其快速、准确、高通量的优点。

　　不管是激酶分析、靶点筛选还是复杂的临床大队列研究，DIA磷酸化蛋白质组均能帮助您快速、准确的解决问题。

　　如果您有DIA磷酸化的需求，请联系我们，博奥麦斯从样本前处理、上机、数据处理，每一步都认真对待，为您提供最真实可靠的数据！

　　参考文献[1] Bekker-Jensen D B , Bernhardt O M , Hogrebe A ,et al. Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling bydata-independent acquisition without the need for spectral libraries[J]. NatureCommunications, 2020, 11(1).[2] Improved Integrated Whole Proteomic andPhosphoproteomic Profiles of Severe Acute Pancreatitis[J]. Journal of ProteomeResearch, 2020, 19(6):2471-2482.[3] Kitata R B , Choong W K , Tsai C F , et al. Adata-independent acquisition-based global phosphoproteomics system enables deepprofiling[J].Nature Communications.