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分子量测定

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> 技术简介

        鉴定蛋白质的大小和纯度最简单的办法莫过于通过SDS-PAGE,但是SDS-PAGE只能测定蛋白质表观分子量,对于蛋白质精确分子量的测定,只能通过MALDI-TOF质谱法。该方法将蛋白质分子离子化后通过质量分析器对其质荷比进行分析,或进一步通过算法得到样品的精确分子量。

> 技术原理

        MALDI-TOF/TOF主要由两部分组成:基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI技术是将样品均匀包埋在基质中,基质吸收激光提供的能量而蒸发,携带部分样品分子进入气相,并将一部分能量传递给样品分子使其离子化。TOF的原理是离子在电场作用下加速通过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同先后被检测,即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比。

 

 

> 技术优势

  可用于大规模数量样本检测;

  不受样本分子量大小的限制;

  高灵敏度、高准确性

> 应用领域

  蛋白分子量测定

> 技术路线

> 实验仪器

  5800 MALDI TOF/TOF™(AB SCIEX)

> 数据分析

  蛋白分子量测定结果

 

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> 研究案例

葡萄糖醛酸木聚糖酶同工酶的定性研究

K. Hayashi, et al. Lett Appl Microbiol. 1996, 22(4):293-8.

> 研究背景

  木聚糖不仅是细胞壁的重要结构,而且是商业化和生物质转化中的目标聚合物。在玉米细胞壁中,由葡萄糖醛酸木聚糖酶释放的木聚糖超过70%。早期研究显示,葡萄糖醛酸木聚糖酶可能存在三种形式。本文基于葡萄糖醛酸木聚糖酶纯化,对该酶及其同工酶进行N端测序、分子量和等电点(PI)测定以及比较GX1和GX2两种亚型的动力学参数和理化性质。

> 研究结果

  测序结果显示GX1亚型木聚糖酶的序列为ASDVTVNVSAEKQVIRGFGGMNHPA WVGDL TAAQR ETAFG NGQNQLGFTI,而GX2亚型的前37位序列与GX1一致。此外,研究者将蛋白酶SDS-PAGE分离后进行MALDI-TOF分子量测定,其中GX1的分子量为44360+100,GX2的分子量为44370+100。毛细管电泳结果显示,GX1的PI为9.0,GX2的PI为9.1。

 

  理化性质比较结果显示,两种亚型在40 ℃,PH6.5条件下活性稳定,当温度超过55 ℃则酶活性下降。而两种酶的最适PH范围有所差别,其中GX1在PH7-8.5条件下活性稳定,GX2在PH5-7条件下稳定。

 

 

样本类型

送样量

纯化后的蛋白溶液或干粉

纯度> 90%,蛋白量>50 μg,浓度>1 μg/μL
挥发性无机盐<20 mM,不挥发性无机盐<5 mM

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